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    熒光抗體染色法

    點擊次數:1133  更新時間:2015-08-31

    一、原理與意義

        免疫熒光組織(細胞)化學染色方法——補體法,是一種熒光抗體染色法。本法之熒光抗體不受免疫血清的動物種屬的限制,因而一種熒光抗體可作更廣泛的應用,敏感性亦較間接法高,效價低的免疫血清亦可應用,節省免疫血清,尤其是對檢查形態小的如立克氏體、病毒顆粒等或濃度較低的抗原物質時甚為理想。

    二、操作指南

    1、材料

    (1)免疫血清60℃滅活20min,用Kolmers鹽水作2倍稀釋成1:2,1:4,1:8……。補體用1:10稀釋的新鮮豚鼠血清,抗補體熒光抗體等,按下述的補體法染色。免疫血清補體結合的效價,如為1:32則免疫血清應作1:8稀釋。

    (2)補體用新鮮豚鼠血清一般作1:10稀釋或按補體結合反應試管法所測定的結果,按2單位的比例,用Kolmers鹽水稀釋備用。Kolmers鹽水配法:即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸緩沖鹽水中,溶解MgSO4的含量為0.01%濃度。

    (3)抗補體熒光抗體:在免疫血清效價為1:4,補體為2單位的條件下,用補體染色法測定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價,然后按染色效價1:4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用。

    2、操作步驟

    (1)涂片或切片固定。

    (2)吸取經適當稀釋之免疫血清及補體之等量混合液(此時免疫血清及補體又都稀釋一倍)滴于切片上,37℃作用30min,置于保持一定濕度的染色盒內。

    (3)用緩沖鹽水洗2次,攪拌,每次5min,吸干標本周圍水液。

    (4)滴加經過適當稀釋之抗補體熒光抗體30min,37℃,水洗同(3)。

    (5)蒸餾水洗1min,緩沖甘油封固。

    3.對照染色

    (1)抗原對照。

    (2)抗血清對照:用正常兔血清代替免疫血清。

    (3)滅活補體對照:將補體經56℃ 30min處理后,按補體同樣比例稀釋,與免疫血清等量混合后,進行補體法染色。

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